Disertantes

Mónica Tous

Resumen

Los reportes de líneas celulares mal identificadas y contaminadas comenzaron en 1968 y continuaron desde entonces manifestando la preocupación de la comunidad científica por las consecuencias sobre los resultados obtenidos. A principios de 2012 se constituyó el ICLACC (International Cell Line Authentication Commitee) a partir de una iniciativa de ATCC y otros bancos celulares internacionales. El objetivo es estandarizar métodos de control, recomendaciones para solicitud de subsidios y publicaciones y mantener actualizada una base de datos de líneas mal identificadas. En base a estas recomendaciones cada vez más revistas científicas solicitan datos de certificación de autenticidad y ausencia de contaminación por micoplasmas, entre otros. Se establecieron requerimientos de control de calidad basados en cinco pilares:

• Control morfológico: consiste en la observación y registro de las características de cada línea. La morfología varía de acuerdo al tipo celular (fibroblástico, epitelial, neuronal, células madre), la densidad del cultivo, la edad (número de pasajes) y cambios en el medioambiente.
• Control de crecimiento: consiste en realizar curvas de cantidad de células en función del tiempo. Cada línea celular tiene una curva característica en determinadas condiciones de cultivo. Sirve para determinar el tiempo de duplicación de la población y las diluciones de repique, además se pueden detectar cambios provocados por alteraciones en el medio o en los protocolos de trabajo o el envejecimiento del cultivo.
• Control de contaminaciones: bacterias, hongos, virus y micoplasmas. La contaminación por micoplasmas es la más diseminada y preocupante ya que no se evidencia en forma macroscópica o al microscopio y es causa de contaminaciones intra e interlaboratorios. Provoca alteraciones a nivel geno y fenotípico en las células infectadas, altera el metabolismo celular y puede afectar la respuesta en los ensayos, aumentar o disminuir la infección viral, producción de antígenos, etc. Los métodos más comunes de detección son cultivo directo, tinción de DNA (Hoescht), métodos inmunoenzimáticos, PCR o real time-PCR.
• Control de cariología: consiste en realizar el análisis citogenético con bandeo cromosómico. Se determina el número de cromosomas, sexo y características cromosómicas. Sirve para identidad y para detectar contaminaciones cruzadas.
• Autenticación: consiste en la verificación de la identidad de especie de la línea. Los métodos recomendados son:
  • PCR multiplex para un pequeño segmento de citocromo oxidasa I (COI) mitocondrial Cada especie presenta una banda característica. Sirve para autenticar la especie de origen y detectar contaminaciones interespecie.
  • Barcode: se amplifica y secuencia la región inicial de 648 pb de la COI y se compara con la base de datos del BOLD system database. Sirve para identificar especie.
  • STR (short tandem repeat): es el gold standard para líneas humanas. Determina la especie e individuo que dio origen a la línea. Cada línea celular posee un perfil alélico propio (fingerprint) que se compara con bases de datos de los bancos certificados. Se utilizan kits de Promega o Applied para detectar 8 o 15 alelos más el de amelogenina para cromosoma X e Y. Sirve para autenticar y detectar contaminación intraespecie. Se están estableciendo bases de datos para otras especies.

Las revistas científicas y las agencias que otorgan subsidios comienzan a solicitar que cuando se empleen líneas celulares se informe el banco del cual se obtuvo la línea, los métodos de autenticación y el control de micoplasmas realizado. En el Servicio Cultivo de Tejidos se realiza control morfológico con registro digital, control de micoplasmas por PCR, verificación especie y ausencia de contaminación cruzada por PCR multiplex para COI y barcoding y STR para líneas celulares humanas. El control morfológico se realiza de rutina y mensualmente los controles de micoplasmas y especies de todas las líneas en cultivo.

Bases de datos:

• Cellosaurus. Base de datos y catálogo de líneas celulares web.expasy.org/cellosaurus/
• ICLACC (Comité Internacional de autenticación de líneas celulares) http://iclac.org/. Líneas celulares con contaminación cruzada: htpp://iclac.org/wp-content/uploads/Cross-Contaminations-v7_2.pdf